Процедура исследования

Питательная среда

Это важнейший компонент анализа чувствительности, к стандартности которого следует предъявлять особо высокие требования.

Неудовлетворительное качество питательной среды, изменение ее компонентного состава способно радикально повлиять на размер зон подавления роста микроба вокруг диска и привести к ошибочным результатам.

В реальных условиях отечественных микробиологических лабораторий для определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам могут быть использованы только две плотные питательные среды: среда АГВ и среда Мюллера-Хинтон. Остальные простые по составу питательные среды (типа МПА) не могут обеспечить надежный воспроизводимый результат, особенно при пограничных размерах зон. Полностью исключается возможность применения обогащенных, дифференциально-диагностических, селективных питательных сред.

Питательная среда, поступающая в микробиологическую лабораторию, должна иметь паспорт с указанием изготовителя, состава среды, качественных характеристик, срока годности, номера серии. Название фирмы изготовителя, название среды, номер серии и срок годности на этикетке должны полностью соответствовать паспортным данным. При наличии разночтений среда признается непригодной к употреблению.

Среда новой серии или любое сомнение в ее качестве требуют входного контроля в соответствии с правилами, приведенными в разделе «Контроль качества анализа».

Из сухой питательной среды, в соответствии с инструкцией, изготавливают готовую питательную среду. Среда может поступить в лабораторию в виде уже готовой («сваренной») питательной среды, требования к документации на нее не отличаются от требований к сухой питательной среде.

Работа с готовой питательной средой требует соблюдения ряда правил.
1. Среду разогревают в водяной бане до полного расплавления. Не кипятить!
2. Чашки Петри, в которые разливают питательную среду, должны иметь ровное дно, острый (не закругленный) угол между стенкой чашки и ее дном. Чашки Петри при разливе среды должны находиться на ровной горизонтальной поверхности, исключающей неравномерность слоя среды по всему диаметру чашки. Толщина столбика питательной среды в чашке должна быть 4-5 мм. Чашки со скошенной средой или с не соответствующей толщиной ее(больше или меньше 4-5 мм) к употреблению не пригодны.
3. При хранении среды (как в колбах, так и в чашках Петри) необходимо предупредить ее высыхание. Поэтому предпочтительно содержать среду в холодильнике при температуре в пределах от 2 до 8°С. Опасность высыхания особо велика, когда среда хранится разлитой в чашках. Рекомендуется их хранить не более 7 суток. Среду в колбах под ватно-марлевой пробкой можно хранить при низкой температуре не более месяца.
4. Перед употреблением среда в чашках Петри не должна содержать на поверхности капли или слой влаги, поскольку это может радикально повлиять на диффузию антимикробного вещества из диска.
Образно говоря, поверхность среды должна быть влажной, но не мокрой. В последнем случае среда должна быть подсушена. Это же относится к крышкам чашек Петри, внутренняя поверхность которых не должна содержать капли влаги.
5. Готовая питательная среда должна иметь рН в пределах от 7,0 до 7,4. При иных значениях рН (при смещении, как в кислую, так и в щелочную область) может существенно измениться и диффузия антимикробного препарата в гель, и рост культуры. А в этом случае, естественно, размер зоны подавления роста перестает быть информативным. Контроль рН должен быть обязательной процедурой. Лучшим образом это делается с помощью рН-метра.
6. Как уже подчеркивалось, различные химические соединения, включенные в питательную среду, фактически делают ее непригодной к употреблению из-за невозможности интерпретировать значения размеров зон подавления роста. Их влияние на стандартность анализа не изучено. Исключением является дефибринированная кровь при условии, что ее используют только при работе с гемофильными микроорганизмами (пневмококк, гонококк, гемофильная палочка).

Диски

Диски - это еще один компонент исследования, стандартность и качество которого в значительной степени определяют информативность исследования.

Диски с противомикробными соединениями изготавливают из специального картона, имеющего определенные показатели качества. Эти требования внесены в утвержденную МЗ РФ нормативную документацию и являются обязательными. Поэтому попытка некоторых производителей и микробиологических лабораторий делать диски из фильтровальной бумаги или картона иных сортов чревата грубыми ошибками. Диски пропитаны соответствующим антимикробным соединением таким образом, чтобы его концентрация в диске соответствовала требуемой. Далее в таблицах приведен перечень дисков, имеющих код государственной регистрации, выпуск которых в нашей стране разрешен. Производителем зарегистрированных Минздравом РФ отечественных дисков является НИЦФ.

Диски, поступающие в лабораторию, должны иметь паспорт с указанием изготовителя, названия противомикробного препарата и его концентрации, показателей качества, срока годности, номера серии. Все перечисленные характеристики (кроме показателей качества) должны быть воспроизведены на этикетке. Разночтения не допустимы. Известны факты подделки номера серии и срока годности дисков. Во всех сомнительных случаях диски возвращаются поставщику или направляются изготовителе для проверки.

Правила, которые следует соблюдать при работе с дисками.
1. Диски должны храниться только в холодильнике; это касается как нераспечатанных, так и вскрытых флаконов. Активность противомикробных препаратов в дисках наилучшим образом сохраняется при низких температурах (в морозильнике). Допустимо хранить диски при температуре до 8°С.
2. Если диски готовятся к использованию, их следует предварительно извлечь из холодильника и в течение 1 2 часов держать закрытыми при комнатной температуре. Только после этого флакон может быть открыт. Нельзя использовать «холодные» диски, поскольку при этом меняется диффузия антибиотиков в гель.
3. Диски следует тщательно оберегать от влаги, как при хранении, так и работе с ними. Это связано с тем, что многие противомикробные средства, переходя в раствор, быстро теряют свои свойства, в т. ч. активность. Желательно кроме этого помещать вскрытый флакон в хорошо закрываемый контейнер или хотя бы пластиковый мешок.
4. На рабочем столе флаконы с дисками не должны подвергаться воздействию прямых лучей солнечного света или находиться в непосредственной близости к источнику высокой температуры.
5. Диски следует извлекать из флакона сухим и стерильным пинцетом. После извлечения диска флакон закрывается пробкой (он не должен стоять на рабочем столе раскрытым).
6. Диски могут использоваться только определенный период; они имеют срок годности. Если срок годности истек, его продление возможно только в порядке исключения после трудоемкого анализа в специализированном учреждении.
7. Диски, используемые в лаборатории, после вскрытия флакона и в период их утилизации (по мере использования) должны контролироваться на их способность обеспечивать надлежащее ингибирование роста референс-культур. Этот вопрос обсуждается далее в
разделе, посвященном контролю качества исследования.

Приготовление инокулюма

Микробиологам известны два подхода к приготовлению инокулюма. В первом варианте, наиболее частом в отечественной практике, используют суточную (18-часовую) культуру микроорганизма, выросшую на плотной питательной среде. Это может быть рост на скошенном агаре. В этом случае микробиолог должен быть убежден в чистоте культуры. Для приготовления инокулюма также могут быть взяты несколько однотипных колоний с поверхности питательной среды в чашке Петри. И в том, и в другом случаях петлей берут небольшое количество культуры и делают по стандарту мутности ее взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия (у нас стандарт обозначают как 5ЕД). После этого взвесь необходимо развести этим же раствором в 10 раз.

Другой вариант (часто используемый за рубежом) - это посев на жидкую питательную среду (МПБ), для чего берут посевной материал с поверхности 3-4 колоний суточной культуры микроорганизма на плотной питательной среде. Используемая бульонная культура должна быть 18 20-ти часовой. Затем ее разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия. В мировой практике этого не требуют. Важно, чтобы плотность взвеси была достаточной, около 108 КОЕ/мл, но не более. На это, порой, достаточно 3-4 часов инкубации. Если взвесь большей плотности, ее разводят той же средой или изотоническим раствором.

При приготовлении инокулюма главная опасность - это его избыточность. Инокулюм должен обеспечить на поверхности питательной среды равномерный, но не плотный газон. Недостаточность посевной дозы легко фиксируется, поскольку вместо гомогенного роста образуются изолированные колонии. Это не приемлемо и в дальнейшем такие чашки не учитывают. Иное дело, когда рост равномерный и плотный. Оценить его «избыточность» не просто, поскольку четких признаков нет. Но подобный микробный газон не допустим, поскольку диаметр зон будет меньше истинной величины, и трактовка результата анализа будет не верна. Может быть дана такая рекомендация: газон должен быть равномерный, рост должен быть сплошным, по колонии должны быть различимы. Эта рекомендация по своей сути является верной, хотя для ее реализации требуется определенный навык. Размер зоны подавления роста микроорганизма в такой ситуации наиболее близок к истинному. Следует внимательно относиться к качеству «стандарта мутности». Он имеет срок годности. При приготовлении инокулюма используемая пробирка по диаметру и толщине стекла должна быть адекватна таким же характеристикам стандарта.

Инокулюм ни в коем случае не должен готовиться впрок, он не подлежит хранению. Приготовленная взвесь должна быть использована в течение ближайших 15 минут.

Процедура исследования

К моменту начала самого аналитического исследования имеются три основных компонента:
- диски, которые после холодильника приобрели комнатную температуру;
- чашки с питательной средой, предварительно подсушенной до исчезновения на ее поверхности конденсата;
- взвесь микробной культуры, подлежащей анализу на чувствительность к антимикробным препаратам.

Производят инокуляцию, посев исследуемой культуры на поверхность питательной среды.

Согласно отечественной практике, 1 - 2 мл взвеси наливают на поверхность питательной среды, покачиванием равномерно распределяют взвесь, пипеткой удаляют избыток взвеси и в течение 10-15 минут приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре. Сама по себе процедура проста и эффективна. Есть только одна реальная опасность. Условия, в которых микробиологи, порой, производят анализ, не всегда обеспечивают достаточное подсыхание поверхности инокулированного агара (низкая температура помещения, избыточная влажность воздуха). Если остается тонкий слой жидкости, и диски будут в нее помещены, то диффузия противомикробного соединения пойдет не в гель, а в жидкость. Сушить же чашки более 15 минут приоткрытыми, также не рекомендуется, поскольку существует опасность сорбции жидкостью каких-либо химических элементов из воздуха. Микробиолог к этому моменту должен относиться очень внимательно.

В некоторых странах предпочитают взвесь наносить на поверхность агара тампоном. Стерильный ватный тампон на держателе погружают в микробную суспензию, ротируют его, чтобы он равномерно пропитался, а затем (это очень важно) тщательно отжимают тампон о сухую стенку пробирки выше уровня жидкости. Затем тампоном культуру наносят на всю поверхность питательной среды, поворачивая чашку каждый раз на 60°. Таким образом, фактически тампоном обрабатывают поверхность агара 4 раза. В этом случае возможность избыточного увлажнения поверхности питательной среды заметно снижается. Такой способ инокуляции надежен и достаточно апробирован.

Накладывают диски. Эта процедура требует соблюдения определенных правил. Диски должны быть распределены по поверхности агара равномерно. Если речь идет об обычной чашке Петри, которая имеет диаметр около 100 мм, то диски следует располагать на расстоянии 2,4 - 2,5 см от центра по кругу. Лучше, чтобы их было не более 6 на чашку. Не следует (как это иногда делается) один дополнительный диск располагать в центре чашки. Если диск нанесен на поверхность питательной среды, его нельзя перемещать на новое место, потому что диффузия некоторых антибиотиков в гель начинается очень быстро.

Целесообразно иметь простое и очень полезное приспособление - трафарет с нанесенными метками (5 или 6 - по кругу, на расстоянии 2,4 см от центра). Его подкладывают под чашку. При боковом освещении метки хорошо видны и именно над ними накладывается диск.

Диск должен быть плотно (без «пустот») прижат к поверхности питательной среды.

Через 15 минут после нанесения диска на питательную среду чашки в перевернутом виде ставят в термостат. Инкубацию ведут при 35°С.

Учет результатов, их интерпретация.

После 18 часов инкубации чашки оценивают по нескольким характеристикам:
1. Газон должен быть сплошным, равномерным и не плотным. Чашки с изолированными колониями или очевидным избыточным ростом выбраковываются. Однако в последнем случае, если результат говорит о чувствительности микроба (даже в такой ситуации), то его можно признать информативным.
2. Учет размера (диаметра) зон подавления роста. Для измерения используют линейку (лучше со скошенным краем и четкими рисками),кронциркуль или шаблон. Чашки желательно держать над темной поверхностью (например, черным не глянцевым листом бумаги). Поверхность среды должна быть хорошо освещена отраженным светом. Линейку или кронциркуль прикладывают к задней поверхности чашки. Если в среду добавлена кровь, то измерение чаще удается сделать только со стороны поверхности среды при снятой крышке.
3. За зону, подлежащую измерению, следует считать тот ее участок, на котором рост отсутствует полностью (среда прозрачна). Не следует учитывать иногда имеющийся слабый рост («ободок») по периферии зоны. Это рост культуры, и он в зону подавления роста не входит. Если внутри зоны имеются колонии, их следует выделить и изучить на принадлежность к исследуемому штамму и на чувствительность к тестируемому антимикробному веществу. Исключения могут быть только при работе с культурой Proteus vulgaris, дающей «ползучий» рост, роение. Если внутри зоны подавления роста протея имеется чуть видная вуаль, то ее можно не учитывать и определять размер зоны по очевидному четкому краю.
Особый подход требуется, когда определяют чувствительность стафилококков к оксациллину и энтерококков к ванкомицину. После традиционного периода инкубации (16 - 18 часов), ее следует продолжить еще в течение 6-8 часов (до полных суток) и в проходящем свете оценить наличие роста внутри образовавшейся зоны. Если он есть, то культуры к этим антибиотикам признаются резистентными, если нет, то чувствительными.
4. Интерпретация результатов исследований ведется по табличным данным.